OPTIMIZACIÓN DE ddPCR Y DESARROLLO DE MÓDULOS MULTIPLEX PARA EL ANÁLISIS DE EVENTOS DE MODIFICACIÓN GENÉTICA EN MAÍZ

Abstract

La siembra, comercialización y consumo de maíz transgénico es motivo de debate en México, ya que es centro de origen y diversificación de variedades y razas de maíz nativo. La reacción en cadena de la polimerasa digital por goteo (droplet digital PCR, ddPCR) ha demostrado ser más eficiente que el estándar de oro para el análisis de maíz modificado genéticamente. Por tanto, el objetivo fue optimizar pruebas de ddPCR para el análisis de transgenes en maíz y generar módulos multiplex de detección. Por medio de un análisis bioinformático se evaluó la aplicabilidad de los iniciadores. Después, con gradientes se determinó una temperatura de hibridación y elongación óptima y se evaluó la concentración de iniciadores, la recuperación de gotas y el efecto “lluvia”. La optimización se verificó por medio de pruebas dúplex, y finalmente se desarrollaron módulos multiplex. La temperatura que permitió una separación clara entre clústeres de gotas positivas y negativas para las 11 pruebas símplex fue 58.5 °C, con concentraciones relativamente bajas de iniciadores y sondas. Las gotas recuperadas resultaron adecuadas según el propósito de los análisis y la “lluvia” obtenida resultó irrelevante. En las pruebas dúplex se confirmó el potencial para la cuantificación sin usar curvas de calibración; la mayoría de los ensayos concordaron con los reportes de validación o con los porcentajes teóricos de variabilidad genética. Por último, en los módulos multiplex se realizaron variaciones en la concentración de iniciadores y sondas para diferenciar clústeres de gotas positivas en un canal detector único. Las mejores diferencias se lograron con concentraciones con diferencias de 1:3. Los resultados mostraron que las pruebas optimizadas son adecuadas para la detección y posible cuantificación de 10 transgenes en maíz.