Poluchenie rekombinantnogo ingibitora ribonukleaz v E. coli dlya ispol'zovaniya v sinteze mRNK in vitro

Abstract

Tekhnologii, lezhashchie v osnove polucheniya sinteticheskih mRNK in vitro, znachitel'no rasshirili vozmozhnosti ih issledovatel'skogo i terapevticheskogo primeneniya. Flagmanskoj oblast'yu primeneniya stala nisha mRNK-vakcin, odnako etot klass terapevticheskih molekul mozhet byt' primenim k gorazdo bolee shirokomu krugu zadach. V osnove processa polucheniya iskusstvennyh molekul RNK lezhit reakciya fermentativnogo sinteza in vitro, odnim iz komponentov kotoroj yavlyaetsya ingibitor ribonukleaz. Etot belok neobhodim dlya zashchity sintezirovannyh RNK ot atak ribonukleaz s cel'yu predotvrashcheniya degradacii molekul, chto kritichno dlya RNK. CHashche vsego ispol'zuyut ingibitor ribonukleaz eukarioticheskogo proiskhozhdeniya, poluchennyj v vide rekombinantnogo belka v kletkah bakterij E. coli. Odnako on yavlyaetsya slozhnoj mishen'yu dlya narabotki v bakteriyah, chto obuslovleno ego strukturoj. Cel'yu raboty bylo proverit' narabotku rekombinantnogo ingibitora ribonukleaz v razlichnyh shtammah E. coli, a takzhe pokazat' vliyanie helpernyh polipeptidov i kletochnyh shaperonov na etot process. Pri pomoshchi podhodov gennoj inzhenerii byli skonstruirovany plazmidy, s kotoryh provodili narabotku himernyh molekul ingibitora ribonukleaz i vspomogatel'nyh polipeptidov. Ocenku vklada razlichnyh komponentov, vliyayushchih na rastvorimost' celevogo rekombinantnogo belka, provodili v hode densitometricheskogo analiza rezul'tatov elektroforeza v PAAG. Opredelili, chto kombinacii vektora s sil'nym promotorom dlya ekspressii gena ingibitora ribonukleazy RNH1 i vspomogatel'nyh polipeptidov MBP i TIG na fone povyshennoj ekspressii kletochnyh shaperonov dnaK, dnaJ, grpE dayut vyhod celevogo produkta 45 mg/l i 60 mg/l sootvetstvenno. Podobrannye usloviya dayut vozmozhnost' krupnomasshtabnyh narabotok etogo belka dlya dal'nejshego ispol'zovaniya v sinteze RNK in vitro pri proizvodstve terapevticheskih preparatov.