РОЛЬ РЕГУЛЯТОРІВ ПЕРЕДАЧІ СИГНАЛІВ G-БІЛКА СІТКІВКИ ЛЮДИНИ НА АКТИВНІСТЬ ГТФ-АЗИ ТРАНСДУЦИНУ

Abstract

Внутрішня ГТФ-азна активність трансдуцину контролює інактивацію ефекторного ферменту, цГМФ-фосфодіестерази (ФДЕ), під час вимкнення зорового сигналу. Показано, що інгібіторна γ-субодиниця ФДЕ (Pγ), неідентифікований мембранний фактор і специфічний для сітківки член родини білків регуляторів передачі сигналів G-білка (RGS) прискорює гідроліз ГТФ трансдуцином. Ми експресували людський гомолог специфічного для сітківки миші RGS (hRGSr) у Escherichia coli та досліджували його роль у регуляції активності ГТФ-ази трансдуцину. Як і інші білки RGS, hRGSr взаємодіяв переважно з перехідною конформацією α-субодиниці трансдуцину, GtαGDPAlF4–, тоді як його зв’язування з GtαGTPγS або GtαGDP було слабким. hRGSr і Pγ не конкурували за взаємодію з GtαGDPAlF4–. Спорідненість взаємодії Pγ- GtαGDPAlF4– була помірно посилена додаванням hRGSr, яка виміряна за допомогою флуоресцентного аналізу зв’язування GtαGDPAlF4– з Pγ, міченим 3-(бромацетил)-7-діетиламінокумарином (PγБК). Зв’язування hRGSr з GtαGDPAlF4– у комплексі з PγБК призвело до максимального зниження флуоресценції БК на 40%, що дозволило оцінити афінність hRGSr до GtαGDPAlF4– (Kd 35 нm). В одному дослідженні обороту hRGSr прискорював ГТФ-азну активність трансдуцину, відновленого за допомогою мембран зовнішнього сегмента стрижня (ЗСС), позбавленого сечовини, більш ніж у 10 разів до швидкості 0,23 с-1. Додавання Pγ до відновленої системи знижувало рівень ГТФази, прискореної hRGSr (kcat 0,085 с-1). ГТФ-азна активність трансдуцину та швидкість інактивації ФДЕ в нативних мембранах ЗСС у присутності hRGSr були підвищені в 3 рази або більше, незалежно від концентрацій мембрани. У суспензіях ЗСС, що містять 30 μм родопсину, ці швидкості перевищували 0,7 с-1. Наші дані свідчать про те, що ефекти hRGSr на активність ГТФ-ази трансдуцину послаблюються Pγ, але не залежать від ймовірного білкового фактора, що активує мембранну ГТФ-азу. Швидкість активності ГТФ-ази трансдуцину в присутності hRGSr є достатньою, щоб корелювати її з кінетикою відключення зорового каскаду in vivo. Ключові слова: фосфодіестерази (ФДЕ), регулятори передачі сигналів G-білка (RGS), сітківка, γ-субодиниця (Pγ), трансдуцин.