Erhöhte NF-κB- und iNOS-Expression in Keratozyten von Keratokonuspatienten – Hinweise auf eine entzündliche Komponente?

Abstract

Zusammenfassung Hintergrund In den letzten Jahren mehren sich Hinweise auf eine entzündliche Komponente beim Keratokonus (KC). Ein Schlüsselgen bei entzündlichen Prozessen ist der Nuclear Factor Kappa B (NF-κB). NF-κB ist ein Transkriptionsfaktor, der unter anderem das Enzym Nitric Oxide Synthase (NOS), das mit dem konkurrierenden Enzym Arginase (Arg) bei entzündlichen Prozessen involviert ist, aktiviert. Ziel dieser Studie war es, die Isotypen von NOS und Arginase zu analysieren, die Expression NF-κB, NOS und Arginase sowie den regulativen Mechanismus von NOS und Arginase in Keratozyten von Keratokonuspatienten mithilfe des Inhibitors 1400W in vitro zu untersuchen. Methoden Primäre humane Keratozyten wurden durch enzymatische Behandlung mit Kollagenase A aus humanen Korneoskleralscheiben (n = 8) und von Explantaten von geplanten perforierenden Keratoplastiken (KC-Patienten) isoliert (n = 8) und in DMEM/F12-Kulturmedium, versetzt mit 5% fetalem Kälberserum, kultiviert. Die Expression von NF-κB, NOS und Arginase wurden mit quantitativer PCR (qPCR) und Westernblot-Analyse (WB) untersucht. Nitrit- und Ureakonzentrationen im Zellkulturüberstand wurden nach Zugabe des NOS-Inhibitors 1400W (0 – 40 µM) analysiert. Ergebnisse In den Keratozyten wurden ausschließlich die Isotypen iNOS (induzierbare NO-Synthase) und Arg-II nachgewiesen. Die mRNA-Expression von NF-κB und iNOS waren in KC-Keratozyten höher als in normalen Zellen (p = 0,0135 und p = 0,0001), während in der Arg-II-Expression keine Unterschiede messbar waren. Im WB war bei NF-κB eine höhere Bandenintensität messbar (p = 0,0012), bei iNOS konnten keine Unterschiede in der Bandenintensität nachgewiesen werden. Im Überstand der KC-Keratozyten wurden geringere Konzentrationen von Nitrit und Urea nach Zugabe des Inhibitors 1400W gemessen (p = ≤ 0,014), nicht jedoch bei normalen Zellen (p ≥ 0,178). Schlussfolgerung Aufgrund der erhöhten Expression von NF-κB und iNOS muss von einer inflammatorischen Komponente beim Keratokonus ausgegangen werden. Die unterschiedliche Regulation der KC-Keratozyten durch den iNOS-Inhibitor 1400W legt eine veränderte metabolische Aktivität nahe, die durch entzündliche Prozesse hervorgerufen werden kann.