In Vitro Nervous Tissue Culture Methods: a Brief Review

Abstract

Nervous tissue investigation has always been in the interest of many scientists. Throughout the whole period of nervous system research, many investigations were conducted on animals in vivo to understand the underlying mechanisms of pathologies and pharmacological effects of medications. However, some research needs are challenging or cannot be fulfilled with in vivo research on animals. Many methods are developed to isolate and culture nervous tissue in vitro to investigate neuronal physiology, disease mechanisms, and drug safety in vitro. Through in vivo studies of a particular organ system, numerous influences of the entire organism interfere with the precise scope of the study. Hence, it is not possible to eradicate the impacts of other organ systems and regulations of the organism before the study of the isolated system in scope. As a solution to this issue, the idea to isolate and keep the wanted tissue in vitro ascended. The tactic of culturing tissues was initiated about a century before. The tissue culture technique was first conducted with aggregated tissue particles, which limited the growth with the radial migration of cells from the tissue particle. Nevertheless, this method gave very restricted prospects for the study, which, successively, served as an opening move for the further development of the approaches. The categories of studies that may be implemented with the tissue cultures embrace elementary studies on cellular metabolism, the regulation of gene expression, and the cell phenotype at different stages of development. Moreover, the tissue cultures can be applicated to immunology, pharmacology, toxicology, tissue regeneration, and transplantation. In obtaining primary neuron cultures, alive cells are used from an organism. Then, these cells are cultivated in cultural media, where they have all the needed materials to maintain their normal life. Neurons have no capacity to divide, and in the primary cultures, they only grow and expand cellular outputs, which are axons and dendrites. Primary neurons can be gained from different parts of a rodent’s brain, and depending on the study objective, that part can be the cortex, hippocampus, or cerebellum. These cultures, parallelly with neurons, may and may not contain glial cells. In some instances, for example, when these cells are the study’s objective, only glial cells may be cultured. As a source of primary cells can serve both embryonal and early postnatal animals. Another type of culturing neuronal tissue, called organotypic culture, is to harvest and culture the whole tissue without disaggregating the cells. Compared to neuronal cell cultures, organotypic cultures are relatively difficult to obtain. Still, as they more accurately represent the complex structure and unity of nervous tissue, new tactics were desired to solve this problem. Steps frontward were the invention of the organotypic slice technique and the roller tube technique to culture organotypic brain slices. In these methods, the intact brain tissue slices are plated on coverslips and semipermeable membranes that are put in nutritious media. Thanks to the technologies and methods of tissue engineering, another possible way to obtain a nervous cell culture is the usage of already differentiated somatic cells. Նյարդային հյուսվածքի հետազոտությունը միշտ եղել է շատ գիտնականների հետաքրքրության շրջանակում: Նյարդային համակարգի հետազոտության ողջ ժամանակահատվածում բազմաթիվ հետազոտություններ են իրականացվել կենդանիների վրա in vivo՝ հասկանալու համար ախտաբանությունների հիմքում ընկած մեխանիզմները և դեղերի դեղաբանական ազդեցությունները: Այնուամենայնիվ, որոշ հետազոտական կարիքներ դժվար են կամ չեն կարող բավարարվել կենդանիների վրա in vivo հետազոտություններով: Մշակվել են բազմաթիվ մեթոդներ՝ in vitro նյարդային հյուսվածքը մեկուսացնելու և մշակելու համար՝ հետազոտելու նեյրոնների ֆիզիոլոգիան, հիվանդությունների մեխանիզմները և դեղամիջոցների անվտանգությունը in vitro: Որոշակի օրգան համակարգի in vivo ուսումնասիրությունների դեպքում ամբողջ օրգանիզմի բազմաթիվ ազդեցությունները խանգարում են հետազոտության կոնկրետ շրջանակին: Հետևաբար, հնարավոր չէ վերացնել օրգանիզմի այլ օրգան համակարգերի և կարգավորման ազդեցությունները, նախքան առանձնացված թիրախային համակարգի ուսումնասիրությունը: Որպես այս հարցի լուծում՝ առաջ է քաշվել հետազոտվող հյուսվածքը in vitro մեկուսացնելու և պահելու գաղափարը։ Հյուսվածքների մշակման մարտավարությունը սկսվել է մոտ մեկ դար առաջ։ Հյուսվածքների կուլտուրայի տեխնիկան առաջին անգամ իրականացվել է ագրեգացված հյուսվածքային մասնիկներով, որոնցում աճը սահմանափակվել է հյուսվածքային մասնիկից բջիջների ճառագայթային գաղթով: Այնուամենայնիվ, այս մեթոդը շատ սահմանափակ հեռանկարներ է տվել ուսումնասիրության համար, ինչը սկիզբ է տվել մոտեցումների հետագա զարգացմանը։ Հետազոտությունների խմբերը, որոնք կարող են իրականացվել հյուսվածքային կուլտուրաներով, ներառում են տարրական ուսումնասիրություններ բջջային նյութափոխանակության, գեների արտահայտման կարգավորման և զարգացման տարբեր փուլերում բջիջների ֆենոտիպի վերաբերյալ: Ավելին, հյուսվածքային կուլտուրաները կարող են կիրառվել իմունաբանության, դեղաբանության, թունաբանության, հյուսվածքների վերականգնման և փոխպատվաստման համար: Առաջնային նեյրոնային կուլտուրաներ ստանալու համար օգտագործվում են օրգանիզմի կենդանի բջիջները։ Այդ բջիջները կուլտիվացվում են կուլտուրային միջավայրում, որտեղ նրանք ունեն բոլոր անհրաժեշտ նյութերը՝ իրենց բնականոն կենսագործունեությունն ապահովելու համար: Նեյրոնները բաժանվելու ունակություն չունեն, և առաջնային կուլտուրաներում դրանք միայն աճում և ընդլայնում են բջջային ելուստները, որոնք աքսոններն և դենդրիտներն են: Առաջնային նեյրոնները կարելի է ձեռք բերել կրծողի ուղեղի տարբեր մասերից, և կախված ուսումնասիրության նպատակից՝ այդ մասը կարող է լինել կեղևը, հիպոկամպը կամ ուղեղիկը: Այս կուլտուրաները, նեյրոնների հետ զուգահեռ, կարող են պարունակել կամ չպարունակել գլիալ բջիջներ: Որոշ դեպքերում, օրինակ, երբ գլիալ բջիջներն են հետազոտության թիրախը, կարող են կուլտիվացվել միայն այդ բջիջները: Առաջնային բջիջների աղբյուր կարող են ծառայել ինչպես սաղմնային, այնպես էլ վաղ հետծննդյան շրջանի կենդանիները: Նեյրոնային հյուսվածքի մեկ այլ տեսակ, որը կոչվում է օրգանոտիպային կուլտուրա, ամբողջ հյուսվածքի ձեռքբերումն ու մշակումն է առանց բջիջների առանձնացման: Նեյրոնային բջիջների կուլտուրաների համեմատ օրգանոտիպային կուլտուրաներ ձեռք բերելը համեմատաբար դժվար է: Այդուհանդերձ, քանի որ դրանք ավելի ճշգրիտ են ներկայացնում նյարդային հյուսվածքի բարդ կառուցվածքն ու միասնությունը, այս խնդիրը լուծելու համար նոր մոտեցումներ են պահանջվում: Առաջընթաց քայլերից էին օրգանոտիպային հատվածային տեխնիկայի և պտտվող անոթի տեխնիկաները` ուղեղի օրգանոտիպային շերտեր մշակելու համար: Այս մեթոդներում ուղեղային ինտակտ հյուսվածքի կտորները տեղադրվում են ծածկապակիների և կիսաթափանցիկ թաղանթների վրա, որոնք դրվում են սննդային միջավայրում: Հյուսվածքների ճարտարագիտության տեխնոլոգիաների մեթոդների շնորհիվ նյարդային բջիջների կուլտուրա ստանալու մեկ այլ հնարավոր միջոց է արդեն տարբերակված մարմնական բջիջների օգտագործումը: Исследование нервной ткани всегда интересовало многих ученых. На протяжении всего периода изучения нервной системы проводилось множество исследований на животных in vivo для понимания глубинных механизмов патологий и фармакологического действия лекарственных препаратов. Тем не менее некоторые исследовательские потребности являются сложными или не могут быть удовлетворены с помощью исследований на животных in vivo. Разработано множество методов выделения и культивирования нервной ткани in vitro для исследования физиологии нейронов, механизмов заболевания и безопасности лекарств in vitro. В исследованиях in vivo конкретной системы органов многочисленные влияния всего организма мешают точному исследованию. Следовательно, невозможно искоренить влияние других систем органов и регуляций организма для изучения изолированной системы интереса. В качестве решения этой проблемы возникла идея выделения и сохранения нужной ткани in vitro. Тактика культивирования тканей была начата примерно за столетие до этого. Техника культивирования ткани была впервые применена к агрегированным частицам ткани, где рост ограничивался радиальной миграцией клеток из частицы ткани. Тем не менее этот метод давал очень ограниченные перспективы для исследования, что впоследствии послужило начальным шагом для дальнейшего развития подходов. Категории исследований, которые могут быть реализованы с культурами тканей, охватывают элементарные исследования клеточного метаболизма, регуляции экспрессии генов и фенотипа клеток на разных стадиях развития. Кроме того, культуры тканей могут применяться в иммунологии, фармакологии, токсикологии, регенерации тканей и трансплантации. При получении первичных культур нейронов используют живые клетки организма. Затем эти клетки культивируют в культуральных средах, где у них есть все необходимые материалы для поддержания нормальной жизнедеятельности. Нейроны не обладают способностью делиться, и в первичных культурах они только растут и расширяют клеточные отростки, которые представляют собой аксоны и дендриты. Первичные нейроны можно получить из разных частей мозга грызунов, и в зависимости от цели исследования этой частью может быть кора, гиппокамп или мозжечок. Эти культуры, наряду с нейронами, могут содержать, а могут и не содержать глиальных клеток. В некоторых случаях, например, когда эти клетки являются целью исследования, можно культивировать только глиальные клетки. Источником первичных клеток могут служить как эмбриональные, так и ранние постнатальные животные. Другой тип культивирования нейронной ткани, называемый органотипической культурой, заключается в сборе и культивировании всей ткани без дезагрегации клеток. По сравнению с культурами нейрональных клеток получить органотипические культуры относительно сложно. Тем не менее, поскольку они более точно отражают сложную структуру и единство нервной ткани, для решения этой проблемы требовались новые тактики. Шагами вперед было изобретение метода органотипических срезов и метода роликовых пробирок для культивирования органотипических срезов мозга.