Preservação da proteína verde fluorescente no tecido ósseo descalcificado

Abstract

A proteína verde fluorescente (GFP) foi originalmente descoberta no cnidário Aequorea victoria. Células-tronco GFP positivas podem ser rastreadas in vivo quando usadas na terapia de doenças. No entanto, no osso, a fluorescência gerada pela GFP pode ser perdida durante o processo de descalcificação, dificultando o rastreamento das células-tronco usadas no tratamento de doenças ou defeitos ósseos. O objetivo deste estudo foi comparar diferentes técnicas de preservação da GFP no tecido ósseo descalcificado. Foram utilizados fêmures de ratas GFP Lewis distribuídos em quatro grupos: 1) descalcificado em ácido fórmico e incluído em parafina; 2) descalcificado em ácido fórmico e submetido à criomicrotomia; 3) descalcificado em EDTA e incluído em parafina; e 4) descalcificado em EDTA com criomicrotomia. Secções de tecido ósseo de todos os grupos foram analisadas para identificação da fluorescência natural e posteriormente submetidas à imunofluorescência, sendo utilizados anti-GFP e Alexa Flúor 555. As imagens foram obtidas por microscopia confocal. Osteócitos, osteoblastos e células da medula óssea de ratos GFP somente tiveram sua fluorescência natural preservada no tecido ósseo descalcificado em EDTA e submetido à microtomia por congelação. Nos demais grupos, houve perda da fluorescência natural, e as células GFP somente puderam ser identificadas com o uso da reação de imunofluorescência com anti-GFP. Conclui-se que a descalcificação em EDTA e a criomicrotomia são as melhores técnicas para preservar a fluorescência natural das células GFP no tecido ósseo e que a visualização de células GFP em tecido ósseo descalcificado em ácido fórmico e incluído em parafina somente pode ser realizada com o uso da técnica de imunofluorescência.