Isolamento e regeneração de protoplastos de Magnaporthe grisea

Abstract

Protoplastos são ferramentas biológicas importantes para pesquisas em fungos filamentosos, sendo empregados intensamente em transformação genética. O isolamento de protoplastos de Magnaporthe grisea foi facilitado com Novozym 234, contudo, este complexo enzimático encontra-se indisponível no mercado. Assim, objetivou-se comparar a eficiência de enzimas líticas disponíveis comercialmente na obtenção de protoplastos de M. grisea. Paralelamente, analisaram-se estabilizadores osmóticos, tempos de digestão e freqüência de regeneração. Maior produção de protoplastos foi obtida com o uso simultâneo de Lysing Enzymes e Cellulase Onozuka R-10. O uso de 10 ou 15 mg de cada complexo enzimático, em 3 mL de estabilizador osmótico, resultou em maior liberação de protoplastos. O melhor estabilizador osmótico foi MgSO4 1,2 M / NaH2PO4 0,01 M, pH 5,8, seguido por MgSO4 0,8 M / NaH2PO4 0,01 M, pH 5,8. O isolamento de protoplastos foi monitorado a cada 60 minutos, atingindo o máximo após incubação por 3 a 6 horas. No entanto, maior freqüência de regeneração (19,4%) foi registrada para protoplastos obtidos após 3 horas de hidrólise enzimática.