«MULTIBAK» Test System for Simultaneous DNA Detection of S. pneumoniae, H. influenzae, N. meningitidis, L. monocytogenes, A. baumannii, P. aeruginosa, S. aureus, K. pneumoniae, E. coli by Multiplex Real-Time PCR

Abstract

Цель. Разработать тест-систему для идентификации основных возбудителей инвазивных бактериальных инфекций методом мультиплексной полимеразной цепной реакции в реальном времени (ПЦР-РВ).Материалы и методы. Основные компоненты тест-системы (праймеры, зонды, контроли) разрабатывались с использованием банка аннотированных нуклеотидных последовательностей GenBank Национального центра биотехнологической информации США (GenBank NCBI USA) [http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank], программами Primer-BLAST/Primer3, FastPCR [http://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/]. Клиническая апробация тест-системы выполнялась на 137 штаммах микроорганизмов, выделенных из разных биологических сред. Идентификация микроорганизмов выполнялась с помощью тест-систем (ID 32 E, rapid ID 32 STREP, ID 32 STAPH, ID 32 GN) на автоматическом микробиологическом анализаторе АТВ Expression фирмы Bio Merieux (Франция). Также применяли комбинированный тест BD Directigen Meningitis Combo Test на основе латекс-агглютинации для прямого количественного определения антигенов H. influenzae типа b, S. pneumoniae, N. meningitidis групп A, B, C, Y, и W135, и E. coli K1.Результаты. Разработанная мультиплексная тест-система полимеразной цепной реакции в режиме реального времени «МУЛЬТИБАК» в 100% специфична для одномоментной идентификации N. meningitidis, S. pneumoniae, H. influenzae, L. monocytogenes, S. aureus, E. coli, K. pneumoniaе,P. aeruginosa, A. baumannii, что подтверждено анализом 137 клинических образцов возбудителей. Высокий диагностический уровень тест-системы характеризуется аналитической чувствительностью не менее 3×102 ГЭ/мл для всех штаммов с диагностической чувствительностью100% и специфичностью 100%. Рассчитанное отклонение воспроизводимости тестсистемы ≤4,2%.Заключение. Тест-система «МУЛЬТИБАК» может применяться для определения ДНК возбудителей первичных бактериальных инфекций (S. pneumoniae, H. influenzae, N. meningitidis,L. monocytogenes) и возбудителей группы нозокомиальных инфекций (A. baumannii,P. aeruginosa, S. aureus, K. pneumoniae, E. coli) в биологических жидкостях методом мультиплексной полимеразной цепной реакции в режиме реального времени. Purpose. To develop a test system for the identification of the main causative agents of invasive bacterial infections by quantitative PCR (qPCR).Materials and methods. The main components of the test system (primers, probes, controls) were developed using data from the GenBank of annotated nucleotide sequences of the US National Center for Biotechnology Information (GenBank NCBI USA) [http://www.ncbi.nlm.nih.gov/ genbank], Primer programs -BLAST/Primer3, FastPCR [http://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer- blast/]. Clinical validation of the test system was performed on 137 strains isolated from different biological fluids. Microorganisms were identified using test systems (ID 32 E, rapid ID 32 STREP, ID 32 STAPH, ID 32 GN) on an automatic microbiological analyzer ATB Expression from Bio Merieux (France). We also used the BD Directigen Meningitis Combo Test based on latex agglutination for the direct quantitative determination of H. influenzae type b, S. pneumoniae, N. meningitidis groups A, B, C, Y, and W135, and E. coli K1 antigens.Results. The developed multiplex real-time polymerase chain reaction test system “MULTIBAC” is 100% specific for the simultaneous identification of N. meningitidis, S. pneumoniae, H. influenzae,L. monocytogenes, S. aureus, E. coli, K. pneumoniae, P. aeruginosa, A. baumannii, which was confirmed by analysis of 137 clinical samples of pathogens.A high diagnostic level of the test system is characterized by an analytical sensitivity of at least 3×102 GE/ml for all strains with a diagnostic sensitivity of 100% and a specificity of 100%. The calculated reproducibility deviation of the test system is ≤4.2%.The multiplex qPCR test system “MULTIBAC” can be used in infectious diseases and clinical medicine. Conclusion. The “MULTIBAC” test system can be used to determine the causative agents of primary bacterial infections (S. pneumoniae, H. influenzae, N. meningitidis, L. monocytogenes) and causative agents of the group of nosocomial infections (A. baumannii, P. aeruginosa, S. aureus, K. pneumoniae,E. coli) in biological fluids using real-time multiplex polymerase chain reaction.