Determination of Thyroid Peroxidase Activity in the Thyroid Tissue of Rats (Experimental Study)

Abstract

Цель. Изучить варианты йодидного метода определения тиреопероксидазы (ТПО) в ткани щитовидной железы (ЩЖ) и разработать наиболее приемлемый метод для выполнения серийных исследований в экспериментах на крысах – как объектах наиболее «удобной» и информативной биологической модели исследования влияния различных экзогенных и эндогенных факторов на образование йодсодержащих гормонов щитовидной железы.Материалы и методы. Для определения активности тиреопероксидазы были использованы гомогенаты ткани щитовидной железы крыс. Инкубационная среда включала в себя фосфатный буфер рН 7,4, йодид калия и аликвоту гомогената/супернатанта. Реакцию проводили в кинетическом режиме при 25 ºС в кювете спектрофотометра после добавления в среду перекиси водорода. Продукт реакции регистрировали по нарастанию оптической плотности при 353 нм. Результаты и обсуждение. Оценивали влияние перекиси водорода на скорость окисления KI, что позволило выбрать концентрацию H2O2, соответствующую оптимальным условиям ре-гистрации кинетики реакции (0,13 ммоль/л). Изучали зависимость скорости реакции от ко-личества белка в пробе, в результате чего был установлен «рабочий» вариант условий для проведения реакции, состоящий во внесении 0,3–0,5 мг белка в 3 мл инкубационной смеси. Определяли влияние концентрации субстрата – KI на скорость реакции. Показано, что линейная зона реакции охватывает интервал концентрации раствора KI: от 5 до 25 ммоль/л.Заключение. Апробированы различные модификации йодидного метода определения активности тиреопероксидазы в ткани ЩЖ животных и человека, произведена их сравнительная оценка, что позволило предложить наиболее приемлемый вариант определения активности тиреопероксидазы в ткани лабораторных животных – крыс.Метод является простым и технически доступным для серийного использования при проведении экспериментальных исследований. Purpose. To study the variants of the iodide method for determination of thyroperoxidase (TPO) in thyroid tissue and develop the optimal method for serial studies in experiments on rats –as the objects of the most «convenient» and informative biological model for studying the influence of various exogenous and endogenous factors on the formation of iodine-containing thyroid hormones.Materials and methods. Rat thyroid homogenates were used to determine thyroid peroxidase activity. The incubation medium included a pH 7.4 phosphate buffer, potassium iodide, and an aliquot of homogenate/supernatant. The reaction was carried out in kinetic mode in a spectrophotometer cuvette after addition of hydrogen peroxide. The reaction product was recorded by increasing the optical density in 353 nm.Results and discussion. The effect of hydrogen peroxide on the oxidation rate KI was evaluated, which let to choose the concentration of H2O2 (0.13 mmol/L) corresponding to the optimal conditions for detecting the reaction kinetics. We studied the dependence of the reaction rate on the amount of protein in the sample, as a result of which a working version was revealed – about 0.3–0.5 mg of protein per 3 ml of incubation mixture. The effect of substrate concentration, KI, on the reaction rate was determined. The linear reaction zone covers the interval from 5 to 25 mmol/L KI. Conclusion. Modifications of the iodide method for determining thyroid peroxidase activity in the thyroid tissue of animals and humans are considered. Testing the various reaction conditions let to develop the best option for thyroid of rats. The method is simple and technically available for serial use in experiments.