Triphosphat‐Pronucleotid (TriPPPro)‐Reporter mit Optimierten Zellpermeablen Farbstoffen zum Metabolischen Labeling von Zellulärer und Viraler DNA in Lebenden Zellen

Abstract

AbstractDas metabolische Labeling von Nucleinsäuren in lebenden Zellen ist von äußerstem Interesse, um die Dynamik des Nucleinsäure‐Stoffwechsels in Echtzeit zu verfolgen und hat somit das Potenzial, neue Einblicke in die Zellbiologie sowie in Pathogen‐Wirtszell‐Interaktionen zu liefern. Eine katalysatorfreie Diels–Alder‐Reaktion mit inversem Elektronenbedarf (iEDDA) mit Nucleosiden, die eine hochreaktive Gruppe wie das axiale 2‐trans‐Cycloocten (2TCOa) tragen, ist ideal geeignet, um die intrazelluläre Markierung von DNA zu ermöglichen. Da Triphosphate von Nucleosiden nicht membranpermeabel sind, ist, nach der Aufnahme in die Zelle, die Phosphorylierung der modifizierten Nucleoside durch zelluläre Kinasen erforderlich. Leider schränkt dabei das enge Substratfenster der meisten endogenen Kinasen die Verwendung von Nucleosid‐Analoga mit hochreaktiven Gruppen ein. Hier wenden wir unseren TriPPPro‐ (Triphosphat‐Pronucleotid) Ansatz an, um einen hoch reaktiven 2TCOa‐modifizierten 2′‐Desoxycytidintriphosphat‐Reporter direkt in lebenden Zellen freizusetzen. Wir zeigen, dass dieses Nucleosidtriphosphat metabolisch in de novo synthetisierte zelluläre und virale DNA eingebaut wird und mit hochreaktiven und zellpermeablen Fluoreszenzfarbstoff‐Tetrazin‐Konjugaten via iEDDA markiert werden kann, um DNA in lebenden Zellen direkt sichtbar zu machen. Damit stellen wir die erste umfassende Methode zur Visualisierung zellulärer und viraler Nucleinsäuren in lebenden Zellen vor.