Eine durchflusszytometrische Ultra‐Hochdurchsatz‐Durchmusterungsmethode für die Gelenkte Evolution von Oxidasen

Abstract

AbstractOxidasen sind bedeutsam für die chemische und pharmazeutische Industrie, da sie hochselektive Oxidationen katalysieren. Allerdings müssen natürlich vorkommende Oxidasen für synthetische Anwendungen häufig mittels Gelenkter Evolution im Labor maßgeschneidert werden. Hierfür haben wir die breit anwendbare und robuste Durchmusterungs‐Plattform “FlOxi” entwickelt. FlOxi ist eine Durchflusszytometriemethode und nutzt Wasserstoffperoxid als Reaktionssnebenprodukt von in E. coli exprimierten Oxidasen, um Fe2+ zu Fe3+ zu oxidieren (Fenton‐Reaktion). Fe3+ vermittelt dabei die Immobilisierung von His6‐“markiertem” eGFP (eGFPHis) auf der E. coli‐Zelloberfläche, wodurch die Identifizierung von aktiven Oxidase‐Varianten mittels Durchflusszytometrie ermöglicht wird. FlOxi wurde mit zwei Oxidasen – einer Galaktose‐Oxidase (GalOx) und einer D‐Aminosäure‐Oxidase (D‐AAO) – validiert. Hierbei wurde in einer Gelenkten Evolutionsrunde eine GalOx‐Variante (T521A) mit einem 4.4‐fach niedrigeren Km‐Wert und eine D‐AAO‐Variante (L86M/G14/A48/T205) mit einem 4.2‐fach höheren kcat‐Wert aufgefunden. FlOxi kann universell für die Gelenkte Evolution von Wasserstoffperoxid‐produzierenden Oxidasen, auch für nicht‐fluoreszierende Substrate, eingesetzt werden.