1. Die im RCA-Prozess eingesetzte ringförmige DNA-Matrize kann enzymatisch oder chemisch durch intramolekulare Ligation von Phosphat- und Hydroxy-Endgruppen synthetisiert werden. In der enzymatischen Synthese (siehe Lit. [15] für ein typisches Syntheseprotokoll) werden die beiden reaktiven Enden einer linearen DNA-Vorstufe durch ein Enzym (z. B. T4-DNA-Ligase) verknüpft. Die enzymatische Synthese ist effizient (Ausbeute >90 %) für relativ große DNA-Substrate, kann aber für kleine ringförmige DNA (<30 nt und insbesondere < 10 nt) ungeeignet sein. Die Ursache hierfür liegt vermutlich in der ungenügenden Absättigung der Enzymbindungsstellen und/oder in der sterischen Spannung, die beim Ringschluss kurzer Oligonucleotide auftritt (siehe Lit. [1b-d]). Dies kann in manchen Fällen ein Hindernis für die Anwendung der RCA-Methode sein, da die enzymatische Synthese die am häufigsten benutzte Strategie zur Herstellung ringförmiger DNA-Matrizen in RCA-basierten Diagnoseassays ist. Man beachte aber, dass die chemische Zyklisierung von DNA-Oligonucleotiden ebenfalls genutzt werden kann, um sowohl kleine (<14 nt; siehe Lit. [1e,f]) als auch große ringförmige DNA-Matrizen (>15 nt; siehe Lit. [1b]) herzustellen. Beispielsweise wurde die chemische Ligation zur Synthese eines ringförmigen DNA-Moleküls mit 13 nt eingesetzt, das das bislang kleinste in einem RCA-Prozess noch wirksame ringförmige DNA-Molekül ist (siehe Lit. [1g]);
2. Convergent DNA synthesis: a non-enzymatic dimerization approach to circular oligodeoxynucleotides
3. T4 RNA ligase: Substrate chain length requirements
4. Catalysis of DNA joining by bacteriophage T4 RNA ligase