Towards isolated microspores culture of red beet

Abstract

Производство удвоенных гаплоидов (УГ) in vitro – ускоренный способ создания чистых линий для селекции коммерческих F1гибридов. Наиболее распространенный метод производства удвоенных гаплоидов у растений рода Beta, главным образом свеклы сахарной, – культура изолированных семязачатков (гиногенез). Недостатки гиногенного способа производства УГ: высокая трудоемкость вследствие ручной изоляции и инокуляции семязачатков на питательную среду и высокая вероятность развития соматических клонов из тканей, окружающих зародышевый мешок семязачатка. Значимая альтернатива для исключения описанных недостатков – культура изолированных микроспор (КИМ). Однако на настоящий момент протоколов рутинного производства УГ свеклы столовой в культуре изолированных микроспор не разработано. Цель исследования: изучение факторов, влияющих на каллусогенез в культуре изолированных микроспор свеклы столовой, и выявление оптимальных условий культивирования микроспор in vitro. В работе нами изучена связь размера бутона, стадии развития микроспор с частотой каллусогенеза методом микроскопирования и культивирования в питательной среде микроспор, выделенных из бутонов различной длины в пределах 1,2–2,7 мм с шагом в 0,3 мм. Культивированием микроспор на питательной среде NLN с добавлением 2,4-Д 0,1 мг/л, НУК 0,1 мг/л, 130 г/л сахарозы и на среде NLN без добавления регуляторов роста, содержащей 130 г/л сахарозы, исследовали влияние питательной среды, температуры культивирования и экспозиции температурной обработки на частоту каллусогенеза изолированных микроспор свеклы столовой. В результате исследования установлены размеры цветковых бутонов 1,2–1,5 мм, содержащие наиболее отзывчивые микроспоры одноядерной стадии развития, и питательная среда NLN с добавлением 130 г/л сахарозы, 0,1 мг/л 2,4-Д и 0,1 мг/л НУК, обеспечивающая наибольший выход каллуса в культуре изолированных микроспор свеклы столовой. Показано, что при примененных условиях температурная обработка изолированных микроспор при разной экспозиции при 32,5 °C не индуцирует эмбриогенез микроспор. Doubled haploids (DH) production in vitro is an accelerated way to create pure lines for breeding commercial F1 hybrids. The most common method for the production of doubled haploids in plants of the genus Beta, mainly sugar beet, is the culture of isolated ovules (gynogenesis). The disadvantages of the gynogenic method for the DH production are high labor intensity due to manual isolation and inoculation of ovules on a nutrient medium and a high probability of development of somatic clones from the tissues surrounding the embryo sac. To eliminate the described disadvantages, the culture of isolated microspores is a significant alternative. However, protocols for the routine DH production of red beet in culture of isolated microspores have not yet been developed. The aim of this study was to study the factors affecting callusogenesis in the culture of isolated red beet microspores and to identify the optimal conditions for their cultivation in vitro. Microspores were isolated from buds 1,2–2,7 mm with a step of 0,3 mm to study the relationship between the bud size and the stage of microspores development with the frequency of callusogenesis and 1,2–1,5 mm to study of the nutrient medium effect, cultivation temperature and the effect of exposure to heat treatment at 32,5 °C on callusogenesis of isolated red beet microspores. Microspores were cultivated on NLN nutrient medium supplemented with 2,4-D 0,1 mg/l, NAA 0,1 mg/l, 130 g/l sucrose and on NLN medium without the growth regulators addition containing 130 g/l sucrose. As a result of the study, the sizes of flower buds were found to be 1,2–1,5 mm, containing the most responsive microspores of the mononuclear stage of development to IMT, and the nutrient medium NLN with the addition of 130 g/l of sucrose, 0,1 mg/l of 2,4-D and 0,1 mg/l NAA, providing the highest yield of microsporogenic callus. It has been shown that under the applied conditions, thermal treatment of isolated microspores at different exposures at 32,5 °C does not induce microspore embryogenesis.