El Ensayo Cometa: una técnica para evaluar genotoxicidad en el ADN de oocitos bovinos

Abstract

Resumen La electroforesis en gel de células individuales o Ensayo Cometa, es frecuentemente usada para medir el daño en el ADN de las células. En la mayoría de estudios, los linfocitos de sangre periférica son utilizados como modelo celular. Sin embargo, en los ˙últimos años, la aplicación de esta técnica se ha extendido a las células germinales, con el fin de evaluar la integridad del ADN espermático, las condiciones de estrés oxidativo en oocitos porcinos y en embriones bovinos; además, la muerte celular en embriones de ratón. Para la realización de la electroforesis de células individuales en un sistema como los oocitos bovinos se hace imprescindible superar dos grandes limitantes en la estructura complejo-cúmulo-oocito (CCOS): una, la degradación de las glicoproteínas de la zona pelúcida y dos, eliminar el nivel de compactación del genoma haploide bovino en metafase II. Dichas limitantes no permiten una migración adecuada del ADN dentro del gel de agarosa. En este estudio se demuestra que el uso de una solución de lisis con proteinasa K durante 3 h y 10 min de corrido electroforético, permite obtener cometas cuantificables de oocitos bovinos madurados in vitro que pueden ser utilizados en estudios genotóxicos en este sistema celular. Summary The single cell gel electrophoresis or the comet assay is used to measure the DNA damage of individual cells, for most studies the lymphocytes from peripheral blood are used as cellular model. However, during the last years, the application of this technique has been extended to the germinal cells with the purpose of evaluating the integrity of the spermatic DNA, oxidative stress conditions in boar oocytes and bovine embryos besides cellular death in mouse embryos. Applying the comet assay to a system such as the bovine oocytes it becomes indispensable to overcome two big structural barriers in the cumulus-oocyte-complex (COC): first, the degradation of the glycoproteins in the zona pellucida and second, the elimination of the flatten level of the haploid metaphase II bovine oocyte genome. These obstacles do not allow an appropriate migration of the DNA through the agarose gel. In this study it is demonstrated that the use of a lysis solution with proteinase K during 3 h and 10 min in electrophoretic running allows to obtain quantifiable comets of bovine oocytes matured in vitro, which can be used in genotoxic studies.