Bakteriyel Kaynaklı Lipaz Geninin Pichia pastoris’te Klonlanması, Ekspresyonu ve Rekombinant Enzimin Saflaştırılması

Abstract

Gıda endüstrisinde enzimler her türlü işleme ve üretim proseslerinde uygulama alanı bulan biyolojik katalizörlerdir. Süt işlemeden meyve suyu üretimine, et işlemeden ekmek üretimine kadar gıda sanayinin çeşitli alanlarında yaygın olarak ihtiyaç duyulan enzimlerden biri lipazlardır. Bu çalışmada, kodon optimize edilmiş Geobacillus stearothermophilus lipaz enzimini kodlayan genin, Pichia pastoris ekspresyon sisteminde güçlü ve indüklenebilir bir promotor olan AOX1 promotoru içeren pPICZA ekspresyon vektörü kullanılarak ekspresyonu yapılmış ve en yüksek lipaz enzimi üretimi gösteren klon belirlenmiştir. Belirlenen klon ile 400 mL indüksiyon besiyerinde 72 saat boyunca üretim gerçekleştirilmiş ve toplanan süpernatant örneğinde enzim aktivitesi, toplam protein ve SDS-PAGE analizi gerçekleştirilmiştir. Rekombinant lipaz enzimi Ni-NTA afinite kromatografisi ile saflaştırılmıştır. Saflaştırma işleminin her aşamasından alınan örneklerde SDS-PAGE analizi yapılmış ve her aşamada elde edilen örneklerde saflaştırma verimi hesaplanmıştır. Saflaştırma işleminden sonra analiz edilen örnekte, en yüksek üretim gösteren klonun 25.02 mg L-1 lipaz üretim seviyesine ulaştığı belirlenmiştir.