Glutatyon S-transferaz: Koyun Dalak Dokusundan Saflaştırılması ve Karakterizasyonu

Abstract

Bu çalışmada, hücre içi majör antioksidan sistem olan glutatyon antioksidan sisteminin önemli enzimlerinden glutatyon S-transferaz (GST; EC 2.5.1.18) sitozolik enzimi koyun dalak dokusundan homojenat hazırlanması, salting out (amonyum sülfat tuzu ile çöktürme yöntemi) ve afinite kromatografisi (glutatyon-agaroz) olmak üzere üç adımda 3.67 EÜ mg-1 protein değeri (spesifik aktivite) ve %3.73 verim ile 122.3 kat saflaştırıldı. Koyun dalak dokusundan saflaştırılan GST enziminin saflık derecesini belirlemek ve doğal alt birim molekül kütlelerinin tespitinde sodyum dodesil sülfat poliakrilamid jel elektroforez (SDS-PAGE) metodu kullanıldı. Koyun dalak dokusu GST enziminin alt birimlerine ait molekül kütlesi yaklaşık olarak 26.36 kDa hesaplandı. Koyun dalak dokusundan saflaştırılan GST enziminin karakterizasyonu için gerçekleştirilen çalışmalarda; optimum pH, K-fosfat tamponu pH=8.0, optimum aktivite gösterdiği iyonik şiddet, K-fosfat tampon çözeltisi 1.0 M, stabil pH, K-fosfat tampon çözeltisi pH = 7.0 ve optimum sıcaklığı 60 oC olarak bulundu. Koyun dalak dokusundan saflaştırılan GST enzimine ait KM ve Vmax değerlerini belirlemek için yapılan kinetik çalışmalarda Lineweaver-Burk grafiklerinden yararlanıldı. Enzimin substratları olan indirgenmiş glutatyon (GSH) ve 1-kloro-2,4-dinitrobenzen (CDNB) için yürütülen kinetik çalışmalarda; GSH için KM değeri 0.629 mM, Vmax değeri 0.056 EÜ mL-1; CDNB için KM değeri 0.321 mM, Vmax değeri 0.129 EÜ mL-1 olarak belirlendi.