Study of the cytotoxic properties of non-oxidized and oxidized bisretinoids of lipofuscin granules in retinal pigment epithelial cells

Abstract

Введение. Липофусциновые гранулы (ЛГ) в клетках ретинального пигментного эпителия (РПЭ) глаза человека содержат бисретиноиды – флуорофоры, способные при поглощении видимого света генерировать активные формы кислорода с образованием, в конечном итоге, окисленных продуктов (окси-БисРет). В состав окси-БисРет входят альдегиды и кетоны, способные диффундировать из ЛГ в цитоплазму клетки РПЭ и оказывать на неё токсическое действие уже в отсутствие света. Цель исследования – изучение механизмов развития апоптоза при цитотоксическом воздействии активных соединений, входящих в составе ЛГ на клетки РПЭ после их облучения видимым светом и последующей темновой адаптации. Методика. Были проведены эксперименты по исследованию цитотоксичных свойств окси-БисРет в темновых условиях с использованием клеточной культуры АРПЭ-19, нагруженной ЛГ. Для поставленной цели применяли следующие методы – определение жизнеспособности, МТТ-тест, ДНК-кометы, флуоресцентный анализ, ВЭЖХ-анализ, проведение иммуногистохимии (апоптоз: каспаза7, каспаза8, ВАХ). Результаты. Сравнительный анализ исходных и предварительно облученных видимым светом образцов показал, что в обоих случаях в клетках РПЭ после темновой адаптации в течение 4 сут запускается апоптоз. Он проходит как по митохондриальному, так и по каспазному пути, однако в случае предварительно облученных образцов с более высоким содержанием окси-БисРет этот процесс проходит заметно интенсивнее. Заключение. Таким образом, можно предположить, что окси-БисРет оказывают цитотоксическое воздействие на клетку РПЭ в отсутствие света и могут рассматриваться как усугубляющий фактор прогрессирования возрастной макулярной дегенерации. Lipofuscin granules (LG) in the cells of the human retinal pigment epithelium (RPE) contain bisretinoids. These fluorophores are capable of generating reactive oxygen species upon absorption of visible light, and this results ultimately in the formation of oxidized products (oxy-BisRet). Oxy-BisRet contains aldehydes and ketones, which can diffuse from the LG into the RPE cell cytoplasm and there have a toxic effect, even in the absence of light. The aim of this study was to determine the mechanisms of apoptosis that results from the cytotoxic effect of active compounds included into LG on RPE cells following their irradiation with visible light and subsequent dark adaptation. Methods. Experiments were carried out to study the cytotoxic properties of oxy-BisRet under dark conditions by using cultured ARPE-19 cells loaded with LG. The following methods were used: determination of viability, MTT test, DNA comets, fluorescent analysis, HPLC analysis, immunohistochemistry for apoptosis, caspase 7, caspase 8, and BAX. Results. A comparative analysis of the control samples and those pre-irradiated with visible light showed that in both cases, apoptosis was triggered in RPE cells after dark adaptation within 4 days. Apoptosis took either the mitochondrial or caspase pathways; however, in pre-irradiated samples with a higher content of oxy-BisRet, this process was noticeably more intense. Conclusion. Thus, oxy-BisRet has a cytotoxic effect on RPE cells in the absence of light and can be considered an aggravating factor in the progression of age-related macular degeneration.