Nokaut mutantnogo TR53 v kletkah linii HaCaT usilivaet ih migracionnuyu aktivnost'

Abstract

Liniya HaCaT — spontanno immortalizovannye nekancerogennye keratinocity cheloveka, shiroko ispol'zuemye v kachestve modeli dlya izucheniya funkcij normal'nyh keratinocitov cheloveka. V genome kletok HaCaT prisutstvuyut dve alleli gena TP53, kotorye soderzhat dve gain-of-function (GOV) mutacii, priobretennye v rezul'tate spontannoj immortalizacii (mutTP53). Nalichie mutacij privodit k uvelicheniyu skorosti proliferacii i narusheniyu programmy stratifikacii. Cel'yu issledovaniya bylo izuchit' vliyanie nokauta gena mutTR53 na sposobnost' keratinocitov linii HaCaT k proliferacii i migracii v modeli povrezhdeniya i regeneracii epidermisa in vitro (skretch-test), a takzhe na sposobnost' formirovat' mnogoslojnyj epitelij v organotipicheskoj modeli epidermisa. Dlya provedeniya skretch-testa kletki kul'tivirovali do obrazovaniya monosloya, zatem nanosili standartizovannoe povrezhdenie. Organotipicheskuyu model' poluchali kul'tivirovaniem keratinocitov v polikarbonatnyh membrannyh vstavkah s diametrom por 0,4 mkm na granice razdela faz (vozduh-zhidkost'). Prodemonstrirovano, chto nokaut mutantnogo gena TP53 privodit k uvelicheniyu migracionnoj sposobnosti keratinocitov linii HaCaT: dlya HaCaT s nokautom mutTP53 zakrytie defekta proiskhodilo bystree po sravneniyu s sootvetstvuyushchej gruppoj WT HaCaT (p < 0,05), na tret'i sutki razmer defekta sostavlyal 12% ± 3% i 66% ± 5% ot pervonachal'nogo. Polucheny dannye, chto mutantnyj TP53 v kletkah HaCaT yavlyaetsya negativnym regulyatorom ekspressii laminina-5 (ekspressiya LAMC2 byla vyshe v kletkah s nokautom mutTP53 v 9,96 ± 1,92 raz, p < 0,05), odnako eto ne sposobstvuet normalizacii programmy differencirovki i stratifikacii epiteliya s obrazovaniem rogovogo sloya v organotipicheskoj modeli.